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目录

  1. 实验原理与基础知识
  2. 实验目的
  3. 实验对象与器材
  4. 关键实验技术
  5. 实验过程：血糖检测方法
  6. 实验过程：小鼠抓取与腹腔注射方法
  7. 实验过程：胰岛素耐量
  8. 实验过程：葡萄糖耐量
  9. 注意事项
  10. 常见问题
  11. 思考题、参考与拓展内容

实验原理与基础知识

随血液运输的葡萄糖是供给机体全身组织细胞的重要能源，维持相对稳定的血糖水平对机体来说极为重要。机体有多种维持血糖稳定的负反馈环路，当血糖水平有所下降时，机体的多种升血糖机制将被激活，降血糖机制则受到抑制，促使血糖逐渐回升至正常水平，这一过程中有胰高血糖素、肾上腺素等多种化学信使的参与；反之，当血糖水平由于进食等原因上升时，机体的降血糖机制则会开始发挥作用，促使血糖尽快降至正常水平，这一过程中胰岛素起着最为关键的作用。

胰岛素是由胰岛的β细胞分泌的一种多肽，是调节机体血糖的重要激素之一。它具有复杂多样的生理效应，整体作用基本上是促进储能、合成代谢与生长。胰岛素的短期降血糖作用是通过增加机体组织（特别是肝脏、肌肉和脂肪组织）对血糖的摄取实现的：正常条件下，胰岛β细胞本身摄取葡萄糖的速率大致与血糖含量正相关，当血糖由于进食等原因升高时，β细胞摄取葡萄糖增加，细胞内供能代谢的产能随之增加，使细胞内ATP含量上升。升高的ATP浓度抑制细胞表面ATP敏感的钾通道，导致膜去极化，引发一系列下游反应，增强胰岛素的释放。胰岛素释放入血后随循环扩散至各组织细胞处，与细胞表面的胰岛素受体结合，一方面通过PI3K/Akt通路增加葡萄糖转运体在细胞膜上的含量，直接增强葡萄糖的摄取，起到快速降血糖的作用；另一方面，胰岛素还可对细胞生命活动的其他方面产生复杂的影响，包括上调多种合成代谢、下调多种分解代谢及细胞自噬、改变分泌活动、调节对其他营养物质的摄取等，在长期促进组织利用营养、储存能量以及生长。当胰岛不能分泌足够量的胰岛素，或机体组织对胰岛素的敏感性下降时，将影响机体对葡萄糖的运输和利用，造成高血糖，甚至糖尿病；而体内胰岛素含量增高时，可使血糖短期内快速下降，严重时会导致惊厥、肌肉抽搐、休克等低血糖现象。

机体对血糖变化的调节能力称为糖耐量。如果机体糖耐失衡，无法正常调节血糖，则容易发生低血糖、高血糖或糖尿病等症状。糖耐量一般通过胰岛素耐量实验或葡萄糖耐量实验来检测，可以评估机体对葡萄糖的代谢能力，在实际研究中常以小鼠为对象进行实验，可为糖尿病、肥胖、胰岛素抵抗等代谢性疾病的研究和治疗提供理论指导。

实验目的

  • 学习小鼠抓取和腹腔注射给药的方法
  • 学习测定小鼠血糖的方法
  • 学习葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验的基本方法
  • 了解胰岛素调节血糖水平的机制

实验对象与器材

  • 小鼠（Mus musculus），注意记录实验所用的小鼠品系
  • 鼠笼，小鼠保定器（1L大量杯）， 1mL注射器，手术剪（眼科剪），干棉球，血糖仪，血糖试纸，防抓咬手套，长柄镊，温度计
  • 生理盐水，50%葡萄糖注射液，0.2IU/mL胰岛素 （如果实际浓度与此不一致，以实际浓度为准）

关键实验技术

  • 小鼠抓取
  • 腹腔注射技术
  • 小鼠血糖测定方法

实验方法：血糖检测方法

将血糖试纸“插入仪器端”插入血糖仪后部插孔内，血糖仪会自动识别并显示试纸型号，有“血滴”闪烁时将血样轻触血糖试纸“进血端口”，血滴会自动吸入，8s后显示结果。记录结果。记录后，拔出血糖试纸，血糖仪自动保存测定结果并关机。可参考文末提供的小鼠空腹血糖信息，比较实验中实际测得的血糖数值。

将试纸插入血糖仪后，注意血糖仪显示的试纸型号是否与实际相符，相符才能继续进行实验。

实验方法：小鼠抓取与腹腔注射

抓取：提起鼠尾，将小鼠从鼠笼中取出，置于鼠笼顶部。用右手向后轻拉鼠尾，在其向前爬行时，用左手食指与拇指稍用力压住其腰部，并不断向前移动手指，直至小鼠耳部，紧紧抓住两耳及耳间皮肤，将小鼠背部置于掌心，以无名指或小指压住尾巴，以中指置于背下，使其身体平直，头部不能自由转动。

注意，一旦出现抓握不牢固，应立即全部松开小鼠，将置于鼠笼顶部，重新进行抓取。切勿在未抓稳的情况下操作小鼠，或试图在手上调整小鼠抓握方式，有被抓咬的风险！

腹腔注射：左手握小鼠，使其腹面向上，头部略低，右手持吸好药物的1mL注射器，沿腹中线与股骨之间的腹部45°角插入腹腔，将药物注射入腹腔后，缓慢退出针头。

实验10 模型1：小鼠胰岛素耐量实验（ITT）

一. 分组与空腹血糖测定

小鼠随机分为对照组和实验组，每组3只，以尾部划线编号。记录小鼠体重以及实验前禁食时间，通常实验前需禁食4~6h。

用右手抓取鼠尾提起，置于实验台上，快速用1L大量杯罩住小鼠身体，将鼠尾在实验台边缘从量杯的杯嘴（倾液嘴）处拉出。在小鼠尾部末端剪掉约1mm，断尾取血，弃去第1滴血，每次取血约2μL（直径约2mm的血滴），轻触血糖试纸“进血端口”，读取并记录血糖数值，记为初始血糖值。

操作小鼠的人员注意戴好防抓咬手套，避免受伤。

二. 药物注射与后续记录

  • 给药

    实验组每只腹腔注射胰岛素0.15mL，对照组每只注射生理盐水0.15mL。注射后，将小鼠放在30~37°C环境中保温并观察小鼠状态。

    【建议】记录每只小鼠完成注射时的时间，如：对照组1 14:30 对照组2 14:45 ，等等。后续所有时间节点都以每只小鼠的实际注射完成时间为准，如取注射后0.5h的第一个样时，对照组1号小鼠在15:00取样，对照组2号小鼠在15:15取样，等等。

  • 取样及数据处理

    每隔30min测量并记录一次小鼠血糖浓度，至给药后2h结束（即注射药物后0.5，1.0，1.5，2.0h分别测量并记录小鼠血糖浓度），以mmol/L计。统计小鼠血糖数据，绘制图表，推断胰岛素和小鼠血糖的关系。

    过程中如小鼠出现角弓反张、乱滚等惊厥反应，肌肉抽搐、休克等低血糖症状时，及时通过背部皮下注射50%葡萄糖来缓解（不超过0.1mL/10g体重）。

  • 动物处死

    所有实验结束后，用颈椎脱臼法处死小鼠：右手捏住小鼠尾根部，将小鼠放在笼盖或粗糙台面上，用左手快速的按住其头部。右手提起鼠尾，使其躯干部与台面成约45°夹角，向后上方拉动，使得其第一颈椎与肩关节脱位，小鼠立即死亡。

    处死时拉动应快速、用力，不用担心把小鼠尾巴拽断，事实上也拽不断。一般而言，脱位成功后会有一声清脆的声音，并且按压小鼠的手可以清楚地摸到小鼠头颈部中间出现了一个空隙，可注意辨别，用以判断处死是否彻底。

实验10 模型2：小鼠葡萄糖耐量实验（GTT）

小鼠葡萄糖耐量实验包括OGTT（口服葡萄糖耐量实验）、IPGTT（腹腔注射葡萄糖耐量实验）和IVGTT（静脉注射葡萄糖耐量实验），本实验采用IPGTT法。

一. 分组与空腹血糖测定

小鼠随机分为对照组和实验组，每组3只，以尾部划线编号。记录小鼠体重以及实验前禁食时间，通常实验前需禁食4~6h。

用右手抓取鼠尾提起，置于实验台上，快速用1L大量杯罩住小鼠身体，将鼠尾在实验台边缘从量杯的杯嘴（倾液嘴）处拉出。在小鼠尾部末端剪掉约1mm，断尾取血，弃去第1滴血，每次取血约2μL（直径约2mm的血滴），轻触血糖试纸“进血端口”，读取并记录血糖数值，记为初始血糖值。

操作小鼠的人员注意戴好防抓咬手套，避免受伤。

二. 药物注射与后续记录

  • 给药

    实验组每只注射20%葡萄糖0.3mL，对照组每只注射生理盐水0.3mL。注射后，将小鼠放在30~37°C环境中保温并观察小鼠状态。

    【建议】记录每只小鼠完成注射时的时间，如：对照组1 14:30 对照组2 14:45 ，等等。后续所有时间节点都以每只小鼠的实际注射完成时间为准，如取注射后0.5h的第一个样时，对照组1号小鼠在15:00取样，对照组2号小鼠在15:15取样，等等。

  • 取样及数据处理

    每隔30min测量并记录一次小鼠血糖浓度，至给药后2h结束（即注射药物后0.5，1.0，1.5，2.0h分别测量并记录小鼠血糖浓度），以mmol/L计。统计小鼠血糖数据，绘制图表，推断葡萄糖注射和小鼠血糖的关系。

  • 动物处死

    所有实验结束后，用颈椎脱臼法处死小鼠，方法与注意事项同前。

注意事项

  • 注意记录小鼠在实验前的实际禁食时间
  • 动物手术时动作要轻柔，尽量避免对动物的刺激或伤害
  • 每次测量结果做好记录

常见问题

  1. 血糖试纸插入后仪器没有反应

    先检查试纸插入方向是否正确以及是否插稳。如果无误，需检查仪器是否有电或损坏，必要时更换仪器尝试。

  2. 同一组内小鼠的血糖差异都很大，怎么办？

    空腹血糖和动物对胰岛素的敏感度都有极大的个体差异，且实验过程中操作小鼠对小鼠造成的刺激也会影响血糖，本实验中每组样本量又较小，组内差异大很正常。在实验现场，只要能看出大致的趋势，就不需要太过担心，一般来说分析数据时一取均值都能看到比较明显的趋势。

    当然，担心检测有误时，也不妨借此提醒一下自己，回想一下有没有弃去第一滴血。

  3. 胰岛素耐量实验中，有小鼠低血糖低得快要死了，怎么办？

    除非惊厥太严重影响抓取，小鼠的低血糖反应也不一定会影响测血糖，注意做好小鼠反应的记录即可。

    如果确实影响了实验记录，紧急处理可以考虑注射葡萄糖并保温。但要注意，注射葡萄糖本身会对血糖造成影响，理论上注射葡萄糖后，注射葡萄糖的小鼠的数据即不能与其他数据形成有意义的对比。做好处理方式的记录（葡萄糖注射量、保温时间等）。

  4. 为什么对照组小鼠的血糖也会下降/上升？

    属于正常现象，如已确定药物注射无误，一般不需处理。实验的前期步骤需要多次操作小鼠，而且最开始往往不熟练，容易对小鼠造成刺激，而应激本身即会使血糖上升。注射完毕之后，对小鼠的操作减少，而且动作逐渐熟练，对小鼠的刺激较小，小鼠应激状态减轻，血糖即有可能下降。一般而言，只要药物注射正确，对照组血糖即使产生变化，幅度也决然不会大于实验组。

  5. 关于处理数据的方式

    Excel自带的统计与制图功能足够完成本实验中的数据处理。可活用average（取均值）函数和stdev.s（样本标准差）函数计算各统计量。

    误差线的设置：制图时，点击图标右上角“+”键，勾选“误差线”一项，点击误差线右侧打开下拉菜单，点击“更多选项”，选择要设置误差线的数据组。

    误差线1

    误差线2

    在误差线选项中的“垂直误差线”设置中，勾选“方向”中的“正负偏差”，勾选“误差量”中的“自定义”，点击“指定值”。

    误差线3

    点击后，将正负错误值改为已计算好的标准差值，方式为选中记录标准差值的单元格。完成后，即可获得带误差线的图像。

    误差线4

    误差线5

思考题、参考与拓展内容

一. 选做内容：小鼠灌胃

左手抓握小鼠，右手持吸好药液的灌胃器，沿小鼠嘴角轻轻插入口腔，将灌胃器针头前翘，沿咽后壁轻轻滑入食道约2.5~3cm，将药物轻轻推入胃内后，小心拔出灌胃器。一般小鼠灌胃给药一次给药量为0.1~0.3mL/10g体重。

【注意】灌胃器针头经过喉头时一定要沿咽后壁向下滑，以免误插入气管导致动物窒息死亡。初次尝试时，给药剂量宜少不宜多，太多很容易导致动物窒息死亡。

二. 思考题

  • 如果在实验中给小鼠注射的胰岛素过多，会观察到小鼠的什么反应？为什么？
  • 试设计实验来测定小鼠血糖的糖阈，也就是不使尿液中出现葡萄糖的最高血糖含量。
  • 设计实验，观察高血糖对小鼠的影响。
  • 设计实验，研究胰岛素调节血糖的机制当中有哪些组织器官参与了血糖调节。

三. 参考与推荐阅读

  1. 生理学实验指导.魏香、谢佐平、苏付荣，编著.清华大学出版社，2005.
  2. 生理学实验指南. 项辉、龙天澄、周文良，主编.科学出版社，2008.
  3. 生理学实验（第四版）.谢景田、刘燕强、崔庚寅，主编.高等教育出版社，2016.
  4. 生理学（第二版）. 姚泰，主编. 北京：人民卫生出版社，2010.

小鼠空腹血糖参考见：Boehm O et al. Clinical chemistry reference database for Wistar rats and C57/BL6 mice. Biological chemistry 388, 547–554 (2007). doi: 10.1515/BC.2007.061. [在线阅读] [查看PDF]